Tip 1, Tip 2, Tip 3 Crispr/Cas sistemi

Tip 1 Crispr/Cas sistemi

Tip 1 Crispr/Cas sisteminin moleküler mekanizmasına Cascade kompleksi ve Cas3 nükleaz eşlik eder. Cascade kompleksi Cas6e ve Cas8 altbirimlerini içerir. Tam Crispr arrayinin transkripsiyonu ile oluşan öncü crRNA (Crispr RNA) ların tekrar spesifik endoribonükleaz Cas3 ile kesilmesi gerekir (A). Bu reaksiyon kısa crRNA lar oluşturur bunlar Cascade kompleksi ile birleşerek hedef DNA da (virüs ya da plazmid) yer alan komplementer protospacer ı bulmak için kullanılır. Cas8, crRNA tarafından tanınan hedef sekansın upstream kısmında yeralan kısa sekans motifini tanır bu motife Protospacer adjacent motif ya da PAM denir. PAM sekansının varlığı hücrenin otoimmün bir reaksiyonu engellemesi açısından gereklidir. PAM sekansı olmadan komplementer crRNA lar hedef DNA yı bulamaz.

Son aşamada, Cascade komplesi/hedef DNA oluşumu Cas3 nükleaz aktivitesini tetikler böylece plazmid ya da bakteriyofajın hedef DNAsında ssDNA kırığı oluşturulur. Böylece parçalanma başlar.

Hedef DNA içerisinde bir “seed sekans” tanımlanmıştır ve crRNA/DNA dubleksinin 5′ ucunda ilk 8 bazın immünite için kritik olduğu gösterilmiştir. Bu sekansta meydana gelen mutasyonların bakteriyofajları E. coli Crispr immünitesinden koruduğu gösterilmiştir. Bununla beraber, seed sekansının 6. nükleotidinde meydana gelecek herhangi bir mutasyonun bu immüniteyi etkilemediği gösterilmiştir.

Tip 2 Crispr/Cas sistemi

Tip 2 sistemi, immünite fonksiyonlarını gerçekleştirmek için sadece Cas9 geni, ya Csn2 (Tip 2A) ya da Cas4 (Tip2B) proteinleri, hedef spacer sekansı, PAM ve iki küçük RNA: crRNA ve trans-encoded crRNA (tracrRNA) gerektirir. PAM, Cas9 PAm-bağlanma domaini tarafından tanınır ve hedef sekansın downstream bölgesinde yer alır. TracrRNA nın iki bölgesi mevcuttur: bir tanesi, Cas9 ile birleşmesine aracılık eden sekonder yapı oluşturur ve diğeri ise, Crispr array nin tekrar sekansına komplementerdir. tracrRA ve öncül crRNA dsRNA oluşturur ve bunun RNaz III ile kesilmesi gerekir. Kesim ürünleri, küçük crRNA rehberleridir (guide). Cas9 da iki nükleaz domaini mevcuttur: RuvC/RNaseH ve McrA/HNH. Bu domainler, istilacı DNA sında crRNA spesifik dsDNA kırıkları oluşturur.
McrA/HNH , baz eşleşmesi olan ipliği keserken, RuvC/RNaseH ayrılmış olan ipliği keser ki, burda bir küt uç oluşturulur (B). DNA hedefinin tanınması Cas9 un PAM sekansına bağlanmasıyla başlar, sonrasında iki DNA ipliği PAM sekansının hemen upstream bölgesinden açılır, r-loop oluşumu ve spacer sekansı 6-8 bazları arasına denek gelen DNA hedefi kesimi tetiklenir.

Tip 3 Crispr/Cas sistemi

Tip 3 Crispr sisteminde, tekrar spesifik endoribonüklaz Cas6, öncül crRNA yı, pre-crRNA tekrarındaki stem loop yapısında bulunan bazdan keser. Bu işlem sonucunda crRNA adı verilen sekans oluşur. Tip 3 alt tipine göre (tip 3a, tip 3b), Cas6 kesimiyle elde edilen küçük crRNA lar, daha büyük komplekse transfer edilir, bunlar sırasıyla Cas 10/Csm veya Cas 10/Cmr dir. Daha sonra, crRNA bu kompleks içerisinde bir olgunlaşma işlemine tabi tutulur, bu işlemde 3′ ucu 6 nükleotid aralıkla kesilir.

Tip 3a da, öncül crRNA 37 ve 43 nükleotidlik uzunlukta crRNA ya olgunlaşır. 3b sistemi Pyrococcus ta gösterilmiştir ve RNA yı hedef alan, prokaryotik immün sistemin ilk örneğidir.

Tip 3 sisteminde, Cas10 kompleksi endoribonükleaz ve endodeoksiribonükleaz aktivitesi içerir: Csm3 ve Cmr4 altbirimleri RNA transkriptlerinin parçalanmasından sorumludur(tip3b) ve Cas10 palm domaini kalıp olmayan DNA kesiminden sorumludur. Şimdiye kadar, hiç bir çalışmada tip 3 sisteminin PAM sekansı ihtiyacına rastlanmamıştır. Bir çalışmada, tip 3 sisteminin, crRNA ve protospacer yakınındaki crispr DNA tekrarları arasında baz eşleşmesine ihtiyaç duyduğu böylece otoimmüteyi engellediği görülmüştür.

Kaynak:crispr: bacteria immune system, chapter 6

Bir Cevap Yazın

Aşağıya bilgilerinizi girin veya oturum açmak için bir simgeye tıklayın:

WordPress.com Logosu

WordPress.com hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Google fotoğrafı

Google hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Twitter resmi

Twitter hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Facebook fotoğrafı

Facebook hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Connecting to %s

%d blogcu bunu beğendi:
search previous next tag category expand menu location phone mail time cart zoom edit close