Crispr/Cas sistemi hangi adımlardan oluşur ?

  1. Adaptasyon:

Crispr/Cas sisteminde ilk basamak adaptasyondur. Bu basamakta gerçekleşen spacer(aralayıcı) alım mekanizması E. coli Type 1 Crispr/Cas sisteminde detaylı olarak çalışılmıştır. Adaptasyon prosesi kabaca iki adımdan oluşur:

  1. İstilacı DNA sından protospacer sekansının seçimi
  2. Protospacer sekansının Crispr array ine katılımı.

Yeni spacer sekans seçiminin ana amacı organizmanın otoimmüniteyi engellemek için kendinden olan ve kendinden olmayan DNA yı ayırd etmek istemesidir. Spacer seçiminin diğer konusu ise, hedef için PAM sekansı gereksinimidir.
Cas9, bakteriyofaj genomunun kesimi için viral hedeflerin downstream bölgesinde yer alan PAM sekansına ihtiyaç duymaktadır. Cas9 fonksiyonel spacer ların PAM sekanslarını tanır ve spacer alımını sağlar. Ayrıca, spacer alımında DNA tamir mekanizması da rol oynamaktadır.

Spacer alımının ikinci aşaması bunların Crispr array ine entegrasyonudur. 2015 te Cas1/Cas2kompleksinin DNA materyalinin alıcı DNA ya entegre ettiğini bunun ise transpozon ve retrovirüs entegrasyonuna benzediği gösterilmiştir. Bu komplekste Cas1 katalitik altbirim görevi görürken Cas2 ise, hemen akabinde entregrasyon aktivitesini arttırır.

2. Ekspresyon Basamağı:

Ekspresyon basamağı 3 kısımdan oluşur:

a) Cas geni ve Crispr ekspresyon regülasyonu

b) Cas kompleksi oluşumu

c)pre-crRNA olgunlaşması

pre-crRNA transkripsiyonu lider sekansı içerisinde bulunan Pcrispr promotoru ile yönlendirilir. Cascade kompleksi proteinlerini kodlayan genlerin transkripsiyonu ise cas genleri upstream bölgesinde yer alan ve polisistronik transkript (Cascade: Cse1, Cse2, Cas7, Cas5 ve Cas6e) Cas1,Cas2 oluşturan Pcas promoturu tarafından yönlendirilir. Ayrıca Crispr/Cas promotorlarının susturulmasında H-NS DNA bağlanma proteininin yer aldığı gösterilmiştir. Diğer Cas genlerinin aksine Cas ise kendi promotorundan sentezlenir.

E. coli K12 de Crispr/Cas sistemi aynı zamanda transkripsiyon aktivatörü olarak çalışan LeuO proteini ile regüle edilir.

3. Crispr İnterferansı:

Crispr interferansı çok basamaklı bir işlemdir. crRNA nın Cas proteinleri ile bir denetleme kompleksi oluşturup onu istilacı nükleik asitlerde ki PAM (protospacer-adjacent motif) ve protospacer seed sekansına yönlendirmesiyle başlar. Protospacer genelde bir dsDNA dır ancak Tip 3B sisteminde bu bir ssRNA dır. Tip 2 ve Tip 3B sisteminde hedef sekansın kesilmesi Cas/crRNA ribonükleoprotein kompleksi aracılıdır, buna karşın Tip 1 ve Tip 3A sistemi Cas nükleaz gerektirir.

Tip 1 sisteminde denetleme kompleksi dsDNA ya bağlanır ve onu keser. Tip 2 sisteminde, Cas9/crRNA/tracr RNA kompleksi hedefe bağlanır ve keser. Tip 3A sisteminde, Csm/crRNA kompleksi ve Csm6 proteini dsDNA ya bağlanır ve keser. Tip 3B sisteminde ise, Cmr/crRNA kompleksi komplementer RNA yı keser.

Kaynaklar: Molecular mechanisms of CRISPR–Cas spacer acquisition

Bir Cevap Yazın

Aşağıya bilgilerinizi girin veya oturum açmak için bir simgeye tıklayın:

WordPress.com Logosu

WordPress.com hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Google fotoğrafı

Google hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Twitter resmi

Twitter hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Facebook fotoğrafı

Facebook hesabınızı kullanarak yorum yapıyorsunuz. Çıkış  Yap /  Değiştir )

Connecting to %s

%d blogcu bunu beğendi:
search previous next tag category expand menu location phone mail time cart zoom edit close